摘要：目的从代谢组学角度对姜炮制-配伍机制进行初步探索。方法采用卵清白蛋白（OVA）＋冰水浴法建立寒饮伏肺哮喘大鼠模型，随机分为对照组、模型组、苓甘五味（生/干/炮）姜辛汤组（SJF/GJF/PJF）及阳性药桂龙咳喘宁组（PC），给药后进行大鼠肺组织HE染色、肺泡灌洗液（BALF）炎性细胞计数，测定血清免疫球蛋白E（IgE）、白细胞介素-4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）水平；同时采用GC-MS代谢组学技术进行非靶向代谢组学研究，寻找寒饮伏肺哮喘大鼠血清、尿液相关差异性代谢物，MetaboAnalyst构建相关代谢通路。结果苓甘五味（生/干/炮）姜辛汤可改善大鼠肺组织病理变化，显著降低大鼠BALF炎性细胞计数及血清中IgE、IL-4水平，升高血清中IFN-γ水平；与对照组相比，寒饮伏肺哮喘大鼠体内共筛选出37种差异性代谢物（血清中15个、尿液中22个），MetaboAnalysis通路分析发现7条代谢通路可能与寒饮伏肺哮喘有关，涉及能量代谢、氧化应激等。苓甘五味（生/干/炮）姜辛汤干预后大鼠整体代谢轮廓趋向正常水平；且苓甘五味（干）姜辛汤治疗寒饮伏肺哮喘作用优于苓甘五味（生/炮）姜辛汤。结论苓甘五味姜辛汤方中姜炮制成干姜入药治疗寒饮伏肺哮喘更为合理，其机制可能通过调节能量代谢、氧化应激等发挥作用。

中药炮制和复方配伍是中医临床用药的两大特色。姜是临床常用中药，常见炮制品有生姜、干姜、炮姜等，前人对姜炮制品有“生姜走而不守，干姜能走能守，炮姜守而不走”的精辟概述，课题组前期研究亦表明姜的不同炮制品中姜酚类成分及药效作用不同[1-2]。中医临床多以复方用药，在复方中研究炮制更为符合临床实际。苓甘五味姜辛汤，出自《金匮要略》，是临床上治疗寒饮伏肺哮喘的经典方剂，该方所选姜为干姜，且以之为君药，具有温中散寒、温肺化饮之功效[3]。课题组前期研究表明姜炮制前后对苓甘五味姜辛汤化学成分影响明显[1]，为了更全面、更系统地揭示姜炮制机制，本实验将姜的不同炮制品纳入苓甘五味姜辛汤复方中进行代谢组学研究。

代谢组学是系统生物学的重要组成部分，能够比较全面地揭示药物治疗疾病过程中生物体系内所发生的变化，该方法强调将人体作为一个完整系统来研究，与中医整体观一致，可为中药炮制配伍理论的探讨提供新的研究思路和强大的技术支持[4-5]。气相色谱-质谱（GC-MS）仪是代谢组学常用分析平台，具有高灵敏度、高分离效率、成本低、大量可用数据库等优点，并且由于其高标准化地应用了电子电离，能产生广泛和高重复性的破裂片段，在代谢组学应用中相对成熟[6-7]。故本实验在前期研究的基础上，建立寒饮伏肺哮喘大鼠模型，以苓甘五味（生/干/炮）姜辛汤为研究对象，利用GC-MS代谢组学技术，研究姜炮制-配伍对寒饮伏肺哮喘大鼠血清、尿液代谢物的影响，从代谢组学角度阐明姜炮制-配伍的作用机制，以期为临床合理选用炮制品及炮制-配伍机制研究提供理论依据。

1材料

1.1仪器

SCION-GC型气相色谱-质谱联用仪，美国Bruker公司，配备美国Bruker公司的CP-自动进样器，质谱检索数据库NIST11.0L；JM-A电子天平（余姚纪铭称重校验设备有限公司）；压缩雾化器（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）；KDC-16H离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），KQDB超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；RM旋转式切片机（德国莱卡公司）。

1.2药品与试剂

卵清白蛋白（OVA，Sigma公司）；瑞士-姬姆萨染色液（南昌雨露实验器材有限公司）；N,O-双（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（BSTFA）-含1%三甲基氯硅烷（TCMS）、甲氧铵盐酸盐、吡啶均购自西亚试剂公司；尿素酶（批号EK）购自上海伊卡生物技术有限公司；血清中免疫球蛋白E（IgE）、白细胞介素-4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）测定试剂盒均购于安迪华泰生物技术有限公司；甲醇（批号）、三氯甲烷（批号）均购自国药化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯。

苓甘五味姜辛汤组方药材干姜、茯苓、甘草、五味子、细辛均购自安徽中医院中药房，经安徽中医药大学李立华主任中药师鉴定，均符合《中国药典》年版规定，为正品药材,其中干姜和炮姜均为同批生姜按照《中国药典》年版方法炮制得到。桂龙咳喘宁胶囊（批号Z），购于桂龙药业有限公司。

1.3动物

SD雄性大鼠48只，体质量（±20）g，购自安徽医科大学，实验动物生产许可证号SCXK（皖）-。动物饲养在室温15～22℃、相对湿度40%～60%的环境下，实验严格遵守国家科学技术委员会颁发的“实验动物管理条例”的相关规定操作。

2方法

2.1苓甘五味（生/干/炮）姜辛汤水煎液的制备

按照《金匮要略》组方配伍，苓甘五味姜辛汤由干姜9g、茯苓12g、甘草9g、五味子5g、细辛5g组成。根据前期优化的最佳煎煮工艺，所需药材12倍量水浸泡40min，武火煮沸后，文火保持微沸40min，滤过，药渣加8倍量水同法煎煮，滤过，合并2次滤液，浓缩至含生药2.2g/mL的苓甘五味（干）姜辛汤水煎液[8]。将组方中干姜分别替换成等量生姜、炮姜，重复以上制备过程，分别得到苓甘五味（生/炮）姜辛汤水煎液。UPLC法测定苓甘五味（干）姜辛汤水煎液主要化学成分质量分数分别为甘草苷0.mg/g、甘草酸单铵盐0.mg/g、6-姜酚0.mg/g、细辛脂素0.mg/g、五味子醇甲0.mg/g[8]。此外，苓甘五味（生/炮）姜辛汤水煎液主要化学成分质量分数分别为甘草苷0.、0.mg/g，甘草酸单铵盐0.、0.mg/g，6-姜酚0.、0.mg/g，细辛脂素0.、0.mg/g，五味子醇甲0.、0.mg/g

2.2寒饮伏肺哮喘大鼠模型的制备及给药

大鼠适应性饲养1周，随机分为对照组、模型组、苓甘五味（生）姜辛汤组（SJF）、苓甘五味（干）姜辛汤组（GJF）、苓甘五味（炮）姜辛汤组（PJF）及阳性药桂龙咳喘宁组（PC），共6组，每组8只。依照参考文献方法[9]，除对照组外，其余各组大鼠在第1、8天均ip0.5mL磷酸盐缓冲液（PBS，每毫升PBS中含mgOVA＋mg氢氧化铝混合溶液），第15天起雾化吸入含1%OVA的PBS溶液激发，每次30min，激发后立即置于（14±2）℃冰水中游泳30min，连续15d，激发期间给予冷水及冰冻饮食，制备寒饮伏肺哮喘模型。且各给药组大鼠分别从激发当天起ig苓甘五味（生/干/炮）姜辛汤水煎液21.6g/kg（按照大鼠与人的体表面积折算后的6倍量及前期预试验结果确定），依照同等剂量换算，PC组ig阳性药桂龙咳喘宁2.43g/kg，各组均连续给药30d，对照组ig同等剂量生理盐水。

以大鼠一般形态、肺组织病理学HE染色、肺泡灌洗液（BALF）中炎性细胞计数，血清中IgE、IL-4、IFN-γ为检测指标，评估大鼠模型是否成功。

2.3大鼠样本收集与处理

2.3.1血清样本收集与处理实验第45天，2%戊巴比妥（50mg/kg）ip麻醉大鼠，腹主动脉取血，冰上放置3h，r/min离心10min，取上清，置于?80℃冰箱中待测。依据文献方法[2]，取?80℃冰箱保存的血清样品，室温下解冻，取μL血清至2mLEP管，加入μL甲醇，10r/min离心10min，取μL上清液于2mLGC-MS进样瓶中室温下氮气吹干；后加入80μL甲氧胺盐试剂（溶于20mg/mL吡啶），轻轻混匀后，37℃孵育2h；迅速向每个样品中加入μLBSTFA（含有1%TCMS），70℃孵育1h，冷却至室温，上机检测。

2.3.2尿液样本收集与处理实验第44天，将各组大鼠置于代谢笼中，正常饮水（禁食），收集24h尿液（加1%叠氮化钠），r/min离心10min，取上清，置于?80℃冰箱中待测。取?80℃冰箱保存的尿液样品，室温下解冻，取尿液μL至2mLEP管，加10μL尿素酶（20mg/mL）37℃孵育1h，再加入μL甲醇-氯仿（3∶1），10r/min离心10min，取μL上清，其余处理同血清。

2.3.3BALF、肺组织收集末次给药后，麻醉大鼠，支气管插管，用5mL注射器向气管内缓慢注入3mL37℃、0.9%氯化钠溶液，迅速回抽灌洗，反复3次（每次约有70%回收量），r/min离心10min，弃上清，留沉淀，4℃保存，待测。获取大鼠BALF后，切除大鼠右上肺中叶，固定在10%中性福尔马林中，待测。

2.4GC-MS条件

2.4.1色谱条件BR-17型石英毛细管色谱柱（μm×0.25μm×30m），载气为高纯氦气，体积流量为1mL/min，分流模式（分流比为20∶1），进样量为1μL，程序升温条件：初始温度为50℃，以8℃/min升温至℃（保持2min），再以4℃/min、8℃/min交替升温至、、、℃，最终至℃（保持2min）。

2.4.2质谱条件EI电离，碰撞能量为70eV；离子源和接口温度分别为、℃，四级杆温度为40℃，全扫描模式，扫描范围为m/z50～。

2.5数据分析和统计

所得到的GC-MS原始数据由Proteowizard（