衰老是生命过程中正常而又复杂的病理生理学现象，与高血压、2型糖尿病、动脉粥样硬化、老年痴呆等疾病密切相关。衰老伴随着细胞凋亡、记忆力下降、免疫力低下、氧化物水平升高以及脑、肝、肾、胸腺等组织的退化及病变，因此，研究效果更好、作用机制清楚的抗衰老药物具有重要意义[1]。五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.Hist.的成熟果实，含有木脂素类、多糖类、挥发油类以及氨基酸、有机酸等多种成分，其中木脂素含量最高，具有镇静安神、收敛固涩、益气生津、补肾宁心等功效[2]。现代药理研究表明，五味子乙素为木脂素主要活性成分，具有明显的保肝、抗炎、抗细胞凋亡、提高记忆力、增强免疫力和抗氧化等作用[3-4]。五味子多糖具有较好的抗衰老、保肝作用，不仅可通过增强免疫功能抗衰老，还可促进神经细胞发育，延缓衰老所致的免疫机能、神经功能减退[5]。脑康灵（复方吡拉西坦脑蛋白水解物片）为一种大脑所特有的肽能神经营养药物，能以多种方式作用于中枢神经，促进脑内蛋白质的合成，具有抗缺氧的保护能力，是公认的治疗痴呆、智力发育迟缓、脑神经功能障碍及记忆力减退等疾病的药物。

本实验以脑康灵为阳性药，通过scD-半乳糖制备小鼠衰老模型，评价五味子粉对小鼠衰老模型肝、脑组织和血浆中丙二醛（MDA）水平，全血中过氧化物酶（CAT）、还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及脑、肝脏、胸腺、脾脏形态变化的影响，验证五味子粉的抗衰老作用。

1材料与仪器

1.1动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22g，山东省实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（鲁）。饲养于河南中医学院实验动物中心。饲料为消毒饲料，垫料为消毒垫料，均由河南省实验动物中心提供。饮水为消毒蒸馏水。饲养条件为温度20～25℃，相对湿度40%～60%，自然光照，每笼6只，常规饲养，隔天更换垫料。

1.2药物与试剂

五味子药材由北京同仁堂制药厂提供，批号，经河南中医药大学代丽萍教授鉴定为木兰科植物五味子S.chinensis(Turcz.)Baill.Hist.的成熟果实；五味子粉自制（五味子药材置于高速多功能粉碎机内粉碎，将粉碎所得药材粉末过目筛，即得）；脑康灵，弘美制药（中国）有限公司，批号；D-半乳糖，Sigma-AldrichLLC.公司，批号G，质量分数≥98%；氯化钠注射液，河南科伦药业有限公司，批号C-2；甲醛，中国莱阳市双双化工有限公司；水合氯醛，天津市光复精细化工研究所；MDA、CAT、SOD、GSHELISA检测试剂盒，苏州卡尔文生物科技有限公司。

1.3仪器

FA（N）/JA（N）系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；HWS12型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；KDC-HR高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；型酶标仪，美国Bio-Rad公司；XLW-Y高速多功能粉碎机，深圳市鑫龙威电子有限公司；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；BA-小鼠避暗仪，成都泰盟软件有限公司。

2方法

2.1分组

取18～22g的小鼠72只，雌雄各半，随机分为6组（雌雄分笼饲养），即对照组、模型组、康脑灵组和五味子粉高、中、低剂量组，每组12只。

2.2造模与给药

造模方法参考文献方法[6-8]，模型组及各给药组小鼠每日颈背部sc5%D-半乳糖生理盐水溶液25mL/kg（1.25g/kg），对照组sc等量生理盐水，每4天称体质量1次，依据体质量调整剂量，连续40d。从实验第11天开始，康脑灵组ig脑康灵（0.g/kg，10mL/kg），五味子粉高、中、低剂量组ig不同剂量五味子粉（3.00、1.50、0.75g/kg，10mL/kg）；对照组和模型组ig等体积的生理盐水，每日1次，连续给药30d，每4天称体质量1次，根据体质量调整用药量。

2.3行为学检测

实验第38天进行避暗法训练小鼠学习能力，暗室通以33V电压，将小鼠放入明室，趋暗习性使小鼠奔向暗室，受到电击后马上逃回明室，如此训练5min。第39天进行记忆测试，以进入暗室为错误反应，以每只鼠从放入明室至进入暗室遇到电击所需的时间为潜伏期，记录5min内的穿梭次数和首次进入暗室的潜伏期，并进行统计学处理。

2.4生化指标检测

末次给药2h后（禁食不禁水12h），小鼠称体质量后眼眶取血，EP管内加入肝素抗凝剂制备全血，按照试剂盒说明书测定全血中CAT、GSH、SOD活性。部分全血离心，分离得到血浆，按照试剂盒说明书测定血浆中MDA水平。

2.5各脏器形态检测

于末次给药前禁食不禁水12h，给药2h后脱颈椎处死小鼠。处死小鼠后，断头，迅速取出全脑，称质量，分离左右脑，左脑于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察各组脑组织的形态变化。右脑制备脑匀浆液，按照试剂盒说明书测定脑匀浆中MDA水平。取肝脏，称质量，一部分肝脏匀浆，检测MDA水平。取肝脏中叶及胸腺、脾脏称质量，于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察各组肝脏、胸腺、脾脏组织的形态变化。采用Ridit检验评价小鼠各脏器组织形态变化。

2.6统计学方法

采用SPSS17.0统计包进行数据资料的统计学处理，结果用表示，各组间比较采用单因素方差分析，方差检验齐性用LSD法，方差不齐性用Games-Howell法检验，等级资料采用Ridit检验。

3结果

3.1五味子粉对衰老模型小鼠避暗行为的影响

由表1可知，与对照组比较，模型组小鼠穿梭次数显著增多，潜伏期显著缩短（P＜0.01）。与模型组比较，脑康灵可以显著减少小鼠明暗穿梭的次数（P＜0.05），五味子粉高、中、低剂量均可显著减少小鼠明暗穿梭的次数（P＜0.01）；脑康灵和五味子粉高、中、低剂量均可显著延长小鼠潜伏期（P＜0.01）。

3.2五味子粉对衰老模型小鼠生化指标的影响

3.2.1对全血中CAT、SOD活性和GSH水平的影响从表2知，与对照组比较，模型组小鼠全血CAT、SOD活性和GSH水平均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，脑康灵和五味子粉高、中、低剂量均可显著升高衰老小鼠全血CAT、SOD活性和GSH水平（P＜0.01）。

3.2.2对血浆、肝匀浆、脑匀浆中MDA水平的影响从表3知，与对照组比较，模型组小鼠血浆、肝匀浆以及脑匀浆中MDA水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，脑康灵和五味子粉高、中、低剂量均可显著降低衰老小鼠血浆、脑匀浆、肝匀浆中MDA水平（P＜0.01）。

3.3五味子粉对衰老模型小鼠脏器组织的影响

3.3.1对脾脏、胸腺、脑、肝脏指数的影响由表4知，与对照组比较，模型组小鼠脾脏指数、脑指数、胸腺指数显著降低（P＜0.05、0.01），肝脏指

数显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，脑康灵能显著升高小鼠脾脏和胸腺指数（P＜0.01）；五味子粉高剂量可显著升高小鼠脾脏和胸腺指数（P＜0.01），显著降低肝脏指数（P＜0.01），明显升高小鼠脑指数（P＜0.05）。五味子粉中剂量可显著升高小鼠胸腺指数和脑指数（P＜0.01），显著降低肝脏指数（P＜0.01）。五味子粉低剂量组可显著升高小鼠胸腺指数和脑指数（P＜0.01），显著降低肝脏指数（P＜0.05）。

3.3.2对脑组织形态的影响电镜观察结果（图1）表明，对照组小鼠大脑皮质神经细胞丰富、排列整齐、着色正常；海马区锥体细胞排列紧密，细胞核圆而大，核仁清晰。模型组小鼠大脑皮质神经细胞明显减少，排列疏松、着色变浅，残存神经细胞固缩变圆，胞浆内出现空泡改变；海马区锥体细胞层数减少，神经元细胞密度下降，排列稀疏、紊乱，可见核固缩现象。脑康灵组和五味子粉中剂量组小鼠大脑皮层细胞以及海马区神经细胞均有所改善；大脑皮层神经细胞数量有所增多，细胞核变大，排列整齐，着色相比模型组有所加深；海马区椎体细胞排列紧密，规则，神经元细胞核圆而大，核仁清晰。五味子粉高、低剂量组小鼠大脑皮层神经细胞有所增加，神经细胞核变大，着色加深；海马区椎体细胞排列整齐，神经细胞核变大。

由表5可知，经Ridit检验，“?”表示大脑皮质神经细胞丰富，排列整齐，着色正常；海马区椎体细胞排列紧密，细胞核圆而大，核仁清晰；“+”

表示大脑皮层神经细胞丰富，排列整齐，着色变浅，神经细胞固缩变小；海马区椎体细胞排列紧密，规则，神经元细胞核圆而大，核仁清晰；“++”表示大脑皮层细胞数量有所减少，排列整齐，着色变浅，神经细胞固缩变圆，胞浆出现空泡；海马区椎体细胞排列整齐，神经细胞体积轻微变小，出现核固缩现象；“+++”表示大脑皮质神经细胞数量显著减少，排列疏松，着色变浅，残存神经细胞固缩变圆，胞浆内出现空泡改变；海马区锥体细胞层数减少，神经元细胞密度下降，排列稀疏、不规则，细胞体积变小，可见核固缩现象。与对照组比较，模型组小鼠脑组织中大脑皮质神经细胞和海马区锥体细胞出现明显的病理变化（P＜0.01）。与模型组比较，脑康灵、五味子粉中剂量可显著改善衰老小鼠脑组织中大脑皮质神经细胞和海马区锥体细胞出现的病理变化（P＜0.01），五味子粉高、低剂量可明显改善衰老小鼠脑组织中大脑皮质神经细胞和海马区锥体细胞出现的病理变化（P＜0.05）。

3.3.3对肝脏组织形态的影响电镜观察结果（图

2）显示，对照组小鼠肝脏细胞无变性、无坏死，肝细胞索排列规则，无炎细胞浸润；模型组小鼠肝脏细胞高度水肿，炎性细胞浸润严重，肝细胞索排列紊乱，可见灶性坏死；脑康灵组小鼠肝细胞病变不明显，肝细胞索排列规则，有少量炎性细胞浸润，局部轻度水肿；五味子粉高、中、低剂量组小鼠肝细胞病变程度减轻，水肿部位较少，肝细胞索排列较规则，几乎没有炎性细胞浸润。

由表6可知，经Ridit检验，“?”表示肝小叶结构清楚，肝细胞索排列规则；“+”表示肝细胞疏松，肿胀，肝细胞索排列紊乱，可见少量炎性细胞浸润；“++”表示肝细胞索排列紊乱疏松，空泡坏死和灶性坏死，可见多个炎性细胞浸润；“+++”表示广泛细胞空泡坏死和灶性坏死，肝小叶内炎性细胞浸润明显。与对照组比较，模型组小鼠肝细胞高度水肿和坏死，炎性细胞浸润严重（P＜0.01）。与模型组比较，脑康灵组小鼠肝细胞病变不明显，水肿明显改善，炎性细胞浸润明显减轻（P＜0.05），五味子粉高、中、低剂量组小鼠肝细胞病变和水肿、炎性细胞浸润显著改善（P＜0.01）。

3.3.4对脾脏组织形态的影响电镜观察结果（图3）表明，对照组小鼠脾脏红髓和白髓分界清晰，脾小结正常，淋巴细胞正常；模型组小鼠红髓和白髓分界模糊，脾小结变小，淋巴细胞正常但稀疏；脑康灵组和五味子粉高、中剂量组小鼠脾脏红髓和白髓分界清晰，脾小结、淋巴细胞未见明显的病理改变；五味子粉低剂量组小鼠脾脏红髓和白髓分界清晰，脾小结、淋巴细胞均基本正常。

由表7可知，经Ridit检验，“?”表示脾脏红髓和白髓分界清晰，脾小结、淋巴细胞正常；“+”表示红髓和白髓分界清晰，脾小结、淋巴细胞基本正常；“++”表示红髓和白髓分界较清晰，脾小结、淋巴细胞病变不明显；“+++”表示红髓和白髓分界模糊，脾小结变小，淋巴细胞稀疏。与对照组比较，模型组小鼠脾脏病变明显，红髓和白髓分界模糊，脾小结变小（P＜0.01）；与模型组比较，五味子粉低剂量组小鼠脾脏红髓和白髓分界清晰，脾小结、淋巴细胞均明显改善（P＜0.05），五味子粉高、中剂量均可显著改善小鼠脾小结、淋巴细胞的病变（P＜0.01）。

3.3.5对胸腺组织形态的影响电镜观察结果（图4）表明，对照组小鼠胸腺小叶边界清楚，髓质皮质分界清晰，淋巴细胞密集正常；模型组小鼠胸腺小叶边界不清，皮质变薄，淋巴细胞排列稀疏；脑康灵组和五味子粉高、中、低剂量组小鼠胸腺小叶边界清楚，髓质皮质分界清晰，淋巴细胞密集未见明显病理改变。

由表8知，经Ridit检验，“?”表示胸腺小叶边界清楚，髓质皮质分界清晰，淋巴细胞正常，排列密集；“+”表示胸腺小叶边界清楚，髓质皮质分界清晰，淋巴细胞基本正常；“++”表示胸腺小叶边界清楚，髓质皮质分界较清晰，淋巴细胞病变不明显；“+++”表示胸腺小叶边界不清，皮质变薄，淋巴细胞疏松。与对照组比较，模型组小鼠胸腺组织小叶边界不清，髓质皮质变薄，淋巴细胞减少（P＜0.01）；与模型组比较，五味子粉高、中、低剂量组小鼠小叶边界清楚，髓质皮质分界清晰，淋巴细胞密集，胸腺组织的病变显著改善（P＜0.01）。

4讨论

衰老是多器官功能减退的生理过程，是生命过程的必然规律。但衰老可诱导阿尔茨海默病、帕金森病、骨质疏松等年龄相关退行性疾病以及代谢综合征、卒中等代谢性疾病的发展，因此有必要研究效果好、作用机制清楚的抗衰老药物[9]。动物长期注射D-半乳糖会引起全身代谢紊乱，导致各器官衰退，这一过程与机体的自然衰老过程相似，是衰老研究中常用的一种动物模型[10]。《神农本草经》将五味子列为上品，具补益强壮之功、奏固涩生津之效，能对人体五脏——心、肝、脾、肺、肾发挥平衡作用。现代研究证实其可作用于心脑血管系统、中枢神经系统、呼吸系统等多个组织系统，具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、增强记忆力等功效[11]。且五味子价廉易得，几乎没有毒副作用。故本实验通过scD-半乳糖建立衰老小鼠模型，评价五味子粉对衰老小鼠模型影响，验证五味子粉的抗衰老作用。

机体的免疫功能与衰老过程密切相关。胸腺与脾脏是机体2种重要的免疫器官，胸腺指数与脾脏指数数值的高低一定程度上能够反映机体胸腺和脾脏免疫功能的状况[12]。肝细胞受到一种或多种可诱发衰老的刺激后，通过反馈调节机制，促进其他肝细胞启动衰老进程，并伴随一系列炎症反应[13]。大脑中的神经细胞是学习记忆存在的基础，海马结构及功能与学习记忆能力密切相关，大脑皮质神经细胞与海马神经元衰老或丢失将严重影响学习与记忆能力[14-15]。故本实验选取胸腺、脾脏、肝脏和大脑组织作为评价五味子粉药效的病理指标。此外，避暗法实验结果表明给予五味子粉治疗后小鼠学习记忆能力明显改善，与已有文献报道的五味子总木脂素或五味子乙素对D-半乳糖所致衰老小鼠显著的记忆改善作用相一致[16]。

机体氧化应激程度的加剧是衰老发生的重要原因之一，GSH是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，能有效缓解机体内的氧化损伤，其含量是衡量机体抗氧化能力的重要指标；MDA是脂质过氧化最重要的产物之一，积累过多可造成细胞结构和功能受损。SOD是脂质过氧化的重要酶，能有效地清除生物氧化产生的超氧阴离子自由基，降低自由基代谢产物MDA的生成，并有终止自由基连锁反应的作用。SOD清除超氧离子自由基，但生成过氧化氢，CAT分解过氧化氢，两者协同方能彻底清除超氧离子。所以CAT、GSH、SOD和MDA可作为反映机体抗氧化能力和清除自由基能力的指标[17-19]。本实验发现，模型组小鼠全血中CAT、GSH、SOD水平显著降低，血浆、肝匀浆以及脑匀浆中MDA水平显著升高，表明衰老小鼠模型体内存在氧化应激损伤；各剂量五味子粉能够通过提高D-半乳糖致衰老小鼠全血中抗氧化酶（SOD、CAT、GSH）的活性和抑制自由基代谢产物（MDA）的生成，改善机体紊乱的自由基代谢，减轻脂质过氧化损伤，从而发挥抗衰老作用。

本研究表明，五味子粉能升高D-半乳糖致衰老模型小鼠全血中CAT、GSH、SOD水平，降低血浆、肝匀浆以及脑匀浆中MDA水平，提高小鼠记忆力，改善脑、肝脏、胸腺、脾脏组织的病理状态与脏器指数，提示该药具有一定的抗衰老功效。

参考文献（略）

来源：苗明三，彭孟凡，刘保松，方晓艳，王坦.五味子粉对D-半乳糖致小鼠衰老模型的影响[J].中草药,,49(13):-.